Il progetto ha 3 obbiettivi, definiti in tre fasi di azioni temporali: 

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Il primo obiettivo

è quello di studiare il ruolo che le proteine Prune-1 e Tubulina-alpha nella dinamica dei microtubuli durante la divisione mitotica. Inoltre, valuteremo se alcune delle mutazioni più frequentemente identificate in questi due geni (PRUNE-1: p.D106N -/- , p.D106N +/-/L270P +/- , p.H292Qfs*3 -/- ; e TUBA1A: p.R2S -/- ) sono responsabili di alterazioni sia nel processo di polimerizzazione dei microtubuli che durante la mitosi. Tali studi saranno effettuati utilizzando cellule (fibroblasti) ottenute da pazienti affetti. Infatti, il nostro laboratorio (sito al CEINGE, Biotecnologie Avanzate, Napoli) ha collezionato fibroblasti primari ottenuti da biopsie cutanee di pazienti affetti da malattie del neurosviluppo causate da diverse mutazioni nei geni PRUNE-1 (p.D106N -/- , p.D106N +/- /L270P +/- , p.H292Qfs*3 -/- ) e TUBA1A (p.R2S -/- ). Su tali fibroblasti saranno effettuate analisi di immunofluorescenze per caratterizzare i difetti mitotici e di segregazione cromosomica (es. presenza di cellule binucleate, difetti di citochinesi, presenza di micronuclei e/o cromosomi come la perdita dei cromosomi o “laggins”, e alterazioni nel numero di centrosomi), per studiare la polimerizzazione dei microtubuli e difetti nella proliferazione cellulare utilizzando un sistema tecnologico (Cell Index) che registra il tasso di crescita cellulare in tempo reale (X-CELLigence, Roche). 

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Il secondo obiettivo

di questo progetto è quello di “produrre in vitro” un sistema neuronale che mima la patologia del bambino per testare l’efficacia di nuove molecole nel “recuperare” i difetti mitotici e di proliferazione causati dalle mutazioni nei geni PRUNE-1 e TUBA1A. A tale scopo, i fibroblasti dei pazienti (descritti sopra) saranno indotti a differenziare in cellule neuronali per sviluppare poi “organoidi cerebrali”, cioè piccoli cervelli umani “cresciuti in vitro” (in collaborazione l’University of Cologne (Germania) nel laboratorio del Prof. Gopalakrishnan). Taliorganoidi ci consentiranno di validare i difetti mitotici precedentemente identificati nei fibroblasti dei pazienti in un sistema neuronale consentendoci di valutare la presenza di segni tipici delle malattie del neurosviluppo: la microcefalia, l’ipoplasia del corpo calloso, l’atrofia ottica e cerebellare. Inoltre, testeremo l’efficacia di nuove piccole molecole sintetizzate in vitro derivate da antagonisti della funzione enzimatica di Prune-1 (in collaborazione con il Prof. Jemielity University of Warsaw del “Centre of New Technologies and the Division of Biophysics”, Faculty of Physics e con il Prof. Fattorusso: Dipartimento di Scienze e tecnologie ambientali biologiche e Farmaceutiche, Università della Campania Luigi Vanvitelli). Tali molecole saranno testate sugli organoidi ottenuti per le varie mutazioni ad oggi identificate (PRUNE-1: p.D106N -/- , p.D106N +/-/L270P +/- , p.H292Qfs*3 -/- ; e TUBA1A: p.R2S -/- ), ed inoltre verranno usati per caratterizzare il sito di interazione tra le molecole e le proteine PRUNE-1 e TUBA1A ricombinante per definire il sito della proteina di interazione e definendo con studi strutturali e conformazionali (tramite tecniche di Spettrometria di Massa) il sito di legame alle proteina e la loro capacità di inibizione e/o di attivazione funzionale delle stesse. Questo studio ci permetterà di valutare la capacità dei farmaci di nuova generazione di interagire con le proteine Prune-1 e TUBA1A ricombinanti e dimostrare l’efficacia in vitro per recuperare il difetto nei fibroblasti dei pazienti affetti ( vedere obiettivo 1) durante le mitosi (nelle divisioni cellulari) e/o negli organoidi generati, mostrando un efficacia sulla funzionalità del sistema neuronale generato in vitro, attraverso misurazioni delle elettrofisiologiche. 

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Il terzo obiettivo

del progetto è quello di validare l’efficacia delle migliori molecole testate in vitro su fibrobalasti ed organoidi nel modello murino knock-in di PRUNE-1 p. D106N-/- di recente generazione nel nostro laboratorio. Il modello murino D106N-/- in omozigosi genera difetti di proliferazione/differenziamento/ migrazione nei precursori neuronali della corteccia del topo. Uno degli obiettivi di questo progetto è quello di valutare la funzionalità dei composti di nuova sintesi nel “prevenire” i difetti mitotici negli stadi embrionali precoci, con dosi adatte tali da essere iniettare in utero in topi durante la gestazione. Noi ci aspettiamo che tali difetti possano essere recuperati per generare un embrione capace di completare lo sviluppo dell’encefalo nel topo. Tali studi preliminari saranno di aiuto per studi traslazionali nell’uomo mirati all’utilizzo futuro di farmaci anti-Prune-1 nella terapia delle malattie del neurosviluppo e delle tubulinopatie in gravidanza laddove è stato possibile osservare, attraverso un indagine genetica la presenza della mutazione causativa della malattia in embrione, durante la gestazione.

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